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小鼠脾臟CD8+T細胞的磁珠分選

更新時(shí)間:2024-06-20      點(diǎn)擊次數:240

一、制備脾臟單細胞懸液

8周齡C57BL/6小鼠摘眼球放血,無(wú)菌分離脾臟,于70um濾網(wǎng)上研磨收集脾細胞,過(guò)濾、離心,再以RPMI-1640wan全培養液重懸。

二、磁珠標記

1. 細胞計數為8×107/mL。

2. 400×g離心4分鐘,去除上清。

3.每107個(gè)細胞總量使用40μL緩沖液重懸。

4.每107個(gè)細胞總量添加10μL CD8+T細胞生物素抗體混合物。

5.混勻,4℃孵育 5分鐘。

6.每107個(gè)細胞加入2mL緩沖液洗滌細胞,400×g離心4分鐘,去上清。

7.每107個(gè)細胞添加80μL 緩沖液。

8.每107個(gè)細胞添加20μL抗生物素磁珠。

9.混勻,4℃孵育 10分鐘。

三、磁珠細胞分選  

1. 將LS分選柱置于相對應的分選器中。

2. 用適當體積的緩沖液潤洗分選柱.

3. 將細胞懸液轉移至分選柱中,收集含有未標記細胞的流出液,即 CD8+T細胞。

4. 加適量的緩沖液,收集總流出物,并與步驟3中的流出液混合,這CD8+T細胞。

四、流式鑒定

1. 將磁珠分選后得到的CD8+T細胞懸液離心,400 ×g,4min,棄去上清。

2. 細胞沉淀中加入1 mL全培養基,計數。

3. 從中取出兩份細胞(一份大概1×106個(gè)細胞),設置為blankCD8+T染色組。

4. CD8+T染色組加入200 μL流式染色緩沖液,再加入5 μL Anti-Mo CD8a,吹打均勻,常溫避光孵育15min;

5. 孵育結束后,PBS洗滌細胞,離心去上清;

6. 加入200 μL流式染色緩沖液,上機檢測。


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